Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей

Исследование проводится по следующей методике. Поверхностную часть донного образца из границы раздела ил/вода аккуратно наносят тонким слоем (до 0,5 мм) на предметное стекло. Иловым мазком покрывают примерно 2/3 поверхности стекла. При нанесении иловых отложений на стекло необходимо стремиться к максимальной выровненности поверхности. Стёкла с иловым мазком рассматривают в УФ-свете (освещение с

верху через опак-иллюминатор). На тёмной поверхности мазка ярко флуоресцируют клетки водорослей, частицы детрита.

Возможны три варианта просмотра препарата на предметном стекле: 1) на предметное стекло наносится капля воды с водорослями, накрывается покровным стеклом и микроскопируется; 2) нанесённая капля просматривается с помощью водного иммерсионного объектива; 3) капля наносится на мембранный фильтр во избежание текучести препарата, накрывается покровным стеклом и просматривается под микроскопом. На покровное стекло наносят каплю анизола для более чёткой видимости объекта.

Подсчет клеток в отражённом свете с применением термопольного конденсатора проводят с учётом в последующем общей численности клеток, полученной при свете клеток в камере Горяева. В полевых условиях при просмотре природного фитопланктона подсчитывают клетки основных преобладающих групп водорослей: зелёных, сине-зелёных, диатомовых. При количественных подсчётах соотношения живых, мёртвых и отмирающих клеток и колоний водорослей готовят серию иловых мазков (4-10), в каждой из которых просчитывают 10 полей зрения по длине илового мазка (а для получения достоверных результатов число полей зрения следует увеличивать до 50-100). Соотношение клеток на разных физиологических этапах выражают в процентах от общей численности или в миллионах (тысячах) на 1мл (миллиардах на 1 литр). Полученные результаты представляют графически в виде таблицы при сравнении с таковыми в контроле.

При подсчёте учитывают три категории свечения: яркие пурпурно-красные клетки или колонии с высокой жизненной активностью; клетки с тускло-красным и оранжево-красным свечением - отмирающие, с низкой жизненной активностью; салатно-зелёные – мёртвые. На основании проведённого просчёта определяют процентное соотношение различных клеток (колоний) водорослей в зависимости от их физиологического состояния. [2]

3.2 Количественная регистрация интенсивности флуоресценции

По характеру нативного свеченияв УФ-лучах можно с достаточной точностью диагностировать степень жизнеспособности клеток водорослей. Однако глазомерные оценки интенсивности свечения требуют выражения их в определённых и достаточно объективных количественных показателях. В связи с изменением спектра флуоресценции клеток водорослей при разных физиологических состояниях (см. выше) возникает необходимость разработки методов быстрой количественной регистрации интенсивности нативного свечения хлорофиллсодержащих клеток, как источника объективной информации о состоянии их жизненной активности.

Для количественного измерения интенсивности свечения может быть использована специальная установка, собранная из отдельных блоков - микроскопа МЛД-1, ФЭУ-22, источника питания Б5-24 (ВС-22), микрорентгенометра, автоматического потенциометра ЭПП-09.

Микроскопирование альгологических объектов проводится с помощью люминесцентного микроскопа МЛД-1, предназначенного для визуального наблюдения объектов в свете их люминесценции, возбуждаемой ультрафиолетовой областью спектра. Принцип работы прибора основан на использовании явления люминесценции объектов, возникающей под действием лучей определённого спектрального состава.

Объекты освещают сверху через опак-иллюминатор и объектив по методу светового поля. Возбуждение люминесценции через объектив, т.е. с той же стороны, что и её регистрация, позволяет в значительной мере уменьшить ошибки, связанные с реабсорбцией люминесценции.

Интенсивность свечения образцов регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя ФЭУ-22, присоединённого к микроскопу через имеющееся в верхней части головки отверстие для фотографирования. ФЭУ питается от стабилизированного источника питания. Регистрация сигналов с ФЭУ осуществляется усилителем постоянного тока с помощью микрорентгенометра и последующей фиксацией на ленте автоматического потенциометра ЭПП-09. Для интенсивности флуоресценции отражающее зеркало откидывают с помощью рукоятки. При этом направляют световой поток на ФЭУ, а величину фототока регистрируют микрорентгенометром.

Величину участка флуоресцирующего препарата регулируют с помощью диафрагм, имеющихся в оптической схеме микроскопа. Используя числовые показатели, можно снимать интенсивность флуоресценции строго с определённого по величине участка. Последний может быть представлен целым трихомом, колонией, пучком трихомов или единичной клеткой.

Особое значение имеет техника приготовления препарата. Для плотных суспензий водорослей с размерами клеток более 10 µ микроскопируют каплю исследуемого образца. Её наносят на предметное стекло, прикрывают покровным и микроскопируют. При исследовании неплотных суспензий с размерами клеток в пределах 4-7 µ отдельную клетку можно выделить только при использовании иммерсионной системы и объективов с увеличением 60-90 и более раз. Поэтому необходимо провести предварительное сгущение образца. Это делают либо путём центрифугирования – микроскопируют осадок, либо после фильтрования определённого объёма суспензии (1-10 мл) через мембранный фильтр. Настройку и чёткость видимости деталей препарата осуществляют с помощью макро- и микровинтов при отсутствии сигнала на ФЭУ. Величина фототока пропорциональна интенсивности свечения и с достаточной чувствительностью регистрируется микрорентгенометром.

Смонтированная по указанной блок-схеме установка даёт возможность не только измерять интенсивность участков препарата и получать количественные характеристики флуоресценции, отвечающие определённым жизненным состояниям клеток водорослей, но и снимать временную характеристику изменения интенсивности свечения, которая позволяет судить о состоянии хлорофилл-белково-липоидного комплекса. [13]

3.3 Оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей

Методы люминесцентного анализа и измерения флуоресценции хлорофилла были применены для оценки степени токсичности отдельных веществ для водорослей, макрофитов, фитообрастаний в лабораторных, полевых и экспедиционных условиях, на модельных экосистемах, а так же для оценки токсичности сточных вод и загрязнения природных водоёмов.

С помощью этого метода можно провести тестирование на культурах водорослей различных веществ: пропанида, смеси сатурна и пропанида, метафоса, смеси фенола и формальдегида. Измерение флуоресценции хлорофилла показывает быструю реакцию фотосинтетического аппарата клеток различных видов водорослей на внесение веществ (самыми токсичными являются пропанид, метафос, смесь пропанида и сатурна). Результаты люминесцентного микроскопирования показывают, что глубокого изменения в клетках водорослей Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda внесение токсикантов не вызывает. Более чувствительна к данным веществам морская жёлто-зелёная водоросль Phaeodactilum trucornutum наблюдается лизис мёртвых клеток в присутствии пропанида и значительное (в 7 раз) снижение численности клеток после внесения в культуру метафоса.

 Скачать реферат