Масс-спектрометрическая оценка уровня включения дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот бактериальных объектов

Methylobacillus flagellatum KT, L-изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина;

Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин;

Выращивание метилотрофных бактерий B. methylicum и M. flagellatum осуществляли на минеральной среде М9 [36] в колбах Эрленмейера объёмом 250 мл с наполне

нием средой 50 мл по методике [23], используя в качестве источников стабильных изотопов (2H)метанол, (13С)метанол и 2Н2O в присутствии L-лейцина для B. methylicum и L-изолейцина для M. flagellatum в концентрациях 10 мг/л. Клетки отделяли центрифугированием (10000 g, 20 мин). В культуральной жидкости анализировали секретируемые аминокислоты.

Для выделения фракции суммарных белков биомассы клетки дважды промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием (10000 g, 20 мин), экспонировали ультразвуком при 40 кГц (3 x 15 мин) и центрифугировали. Полученный осадок (10 мг) после отделения липидов и пигментов смесью органических растворителей хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) использовали в качестве фракции суммарных белков биомассы.

Для получения дейтериймеченого бактериородопсина использовали синтетическую среду, содержащую 18 аминокислот, в которой немеченые L-аминокислоты фенилаланин, тирозин и триптофан были заменены их дейтерированными аналогами - [2,3,4,5,6-2Н]фенилаланином, [3,5-2Н]тирозином, и [2,4,5,6,7-2Н]триптофаном (количества компонентов приведены в г/л): (D, L-аланин 0.43, L-аргинин 0.4, D, L-аспарагиновая кислота 0.45; L-цистеин 0.05; L-глутаминовая кислота 1.3; L-глицин 0.06; D, L-гистидин 0.3; D, L-изолейцин 0.44; L-лейцин 0.8; L-лизин 0.85; D, L-метионин 0.37; D, L-фенилаланин 0.26; L-пролин 0.05; D, L-серин 0.61; D, L-треонин 0.5; L-тирозин 0.2; D, L-триптофан 0.5, D; L-валин 1.0); нуклеотиды (аденозин-5-монофосфат 0.1; уридин-5 монофосфат 0.1); соли (NaCl 250; MgSO4 x 7H2O 20; KСl 2; NH4Cl 0.5; KNO3 0.1; KH2PO4 0.05; K2HPO4 0.05; цитрат натрия 0.5; MnSO4 x H2O 3 x 10-4; CaCl2 x 6H2O 0.065; ZnSO4 x 7H2O 4 x10-5; FeSO4 x 7H2O 5 x 10-4; CuSO4 x 5H2O 5 x 10-5); глицерин 1.0; ростовые факторы (биотин 0.1 x 10-3; фолиевая кислота 10 x10-3; витамин В12 0.02 x 10-3).

Для выделения фракции пурпурных мембран клетки, полученные после отделения культуральной жидкости и двухкратной промывки дистиллированной водой (100-150 мг), суспендировали в 100 мл 0.1 М буфера трис-HCl (рН 7.6), добавляли 1 мг дезоксирибонуклеазы I и инкубировали в течении 5-6 ч при 37 0С, затем разбавляли дистиллированной водой до 200 мл и инкубировали 15 ч при 4 0С. Осадок промывали дистиллированной водой с последующим отделением водной фракции до получения бесцветных промывных вод. Чистоту полученной суспензии пурпурных мембран (в Н2О) контролировали на спектрофотометре Beckman DU-6 (США) по соотношению полос поглощения 280/568 нм (e280 1.1 x 105 М-1см-1 [37] и e568 6.3 x 104 М-1 см-1 [38]).

Бактериородопсин выделяли по методу [39], солюбилизируя препараты пурпурных мембран (50 мг) в 2 мл 0.5% раствора SDS в Н2О и осаждая продукт 5-кратным избытком метанола на холоду (00 С). Выход бактериородопсина составил 17-20 мг.

Электрофорез препаратов бактериородопсина проводили в 12.5% ПААГ с 0.1 % SDS. Образцы для электрофореза готовили стандартным способом (протокол фирмы LKB, Швеция). Для количественного определения содержания синтезированного в клетке белка проводили сканирование прокрашенного в растворе Кумасси-голубой R-250 электрофоретического геля на лазерном денситометре CDS-200 (Beckman, США).

Липиды и пигменты экстрагировали смесью хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) по методу Блайя и Дайера [40].

Гидролиз белка проводили 6 М 2НСl (3% фенола в 2Н2О) или 2 М Ва(ОН)2 (1100С, 24 ч) [41].

N-Dns-аминокислоты. К 4-5 мг лиофилизованных препаратов культуральной жидкости и белковых гидролизатов в 1 мл 2 М NaHCO3 рН 9-10 порциями при перемешивании добавляли 25.6 мг дансилхлорида в 2 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при перемешивании при 400 С, затем подкисляли 2 М HСl до рН 3.0 и экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.

Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот. Для получения диазометана к 20 мл 40% КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После окончания интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли, промывали ледяной водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки препаратов N-дансиламинокислот в составе культуральной жидкости или гидролизатов суммарных белков биомассы.

N-Cbz-аминокислоты. К 1.5 мл охлажденного до 00С раствора культуральной жидкости (50 мг) или белковых гидролизатов (4-5 мг) в 4 М NaOH добавляли порциями при перемешивании 2 мл 4 М NaOH и 28.5 мг бензилоксикарбонилхлорида. Реакционную смесь выдерживали при 00С, перемешивали 3 ч, подкисляли 2 М HCl до рН 3 и продукты экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.

ТСХ производных аминокислот осуществляли на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) в системах растворителей: хлороформ-метанол-уксусная кислота, 10:1:0,3 (А) для N-Cbz-аминокислот и хлороформ-метанол-ацетон, 7:1:1 (Б) для метиловых эфиров N-Dns-аминокислот.

N-Cbz-аминокислоты детектировали по поглощению при 254 нм. Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот детектировали по флуоресценции в УФ-свете.

Аналитическое и препаративное разделение смеси N-Cbz-аминокислот культуральной жидкости и белковых гидролизатов осуществляли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ [31].

Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот разделяли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Knauer, УФ-детектором 2563 и интегратором С-R 3A (Shimadzu, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C18; 18.7 мкм; 150 x 3.3 мм (Kova, Чехо-Словакия); система растворителей: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота, (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали градиентное элюирование: от 0 до 20% В 5 мин, 20 до 100% В 30 мин, 100% В 5 мин, от 100 до 0% В 2 мин, 0% В 10 мин.

Ионнообменную хроматографию белковых гидролизатов осуществляли на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230 x 3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи натрий-цитратного буфера 18,5; нингидрина - 9,25 мл/ч; детекция при 570 и 440 нм (для пролина).

Секретируемый L-фенилаланин и L-лейцин определяли на приборе Beckman DU- 6 (США) при 540 нм, в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после её обработки нингидрином.

Масс-спектры электронного удара производных аминокислот снимали на приборе MB-80 A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ.

СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ.

1. Beaufrere B., Fournier V., Salle B., Putet G. // American Journal of Physiology. 1992. V. 263. ¹. 1. P. 214-220.

 Скачать реферат