Инструкция о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных

4. Серологическая диагностика лептоспироза

4.1. Серологическая диагностика лептоспироза основана на обнаружении специфических антител в крови животных, реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией микроагглютинации (РА).

4.2. Сыворотку крови животных исследуют на лепто-спироз по РМА или РА для выяснения благополучия хозяйства по этому заболеванию и установления диагноза на лепто

спироз у отдельных животных.

В последнем случае проводят 2–3-кратное исследование. Кровь берут для исследования на 5–7-й день болезни и повторно через 7–10 дней.

4.1. Порядок постановки и учета реакции микроагглютинации (РМА)

4.1.1. Для постановки реакции микроагглютинации необходимы:

– исследуемая сыворотка крови животных;

– антигены – культуры диагностических штаммов лептоспир;

– электролит – физиологический раствор;

– микроскоп, конденсор темного поля и осветитель те же, что для микроскопической диагностики;

– агглютинационные пластинки или пробирки Флоринского;

– 40–100-гнездные штативы;

– бактериологические пробирки;

– градуированные пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл;

– аппарат Флоринокого;

– предметные стекла.

4.1.2. Исследуемая сыворотка. Для исследования пригодна сыворотка свежая, замороженная, высушенная на фильтровальной бумаге, консервированная фенолом или борной кислотой. Консервируют отстоявшуюся сыворотку, слитую в сухие стерильные пробирки.

Добавляют 5%-ный раствор фенола при постоянном помешивании 0,05 мл (1 капля) на каждый миллилитр сыворотки. Зеркальная тонировочная пленка пленка зеркальная на окна.

Борную кислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадать в пипетку во время постановки реакции.

Высушивают сыворотку на квадратах (5X5 см)' белой фильтровальной бумаги по 3–5 капель (0,05 мл каждая) при комнатной температуре или в термостате при температуре 37 °С. Консервированные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. Гемолизированные, загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют.

4.1.3. Антигены. В качестве антигенов в РМА используют живые культуры лептоспир различных серологических групп. Республиканские лаборатории ставят реакцию с лептоспирами 13 серологических групп: Icterohaemorrhagiae, Javanica, Canicola, Pyrogenes, Cynoptery, Autumnalis, Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Tarassovi, Bataviae, Australis, Ballum.

Краевые, областные, межрайонные лаборатории исследуют сыворотку домашних животных с антигенами 6 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Hebdomadis, Canicola.

Сыворотку крови диких животных исследуют с лептоспирами 13–15 серогрупп.

В РМА используют эталонные штаммы лептоспир или их аналоги, рекомендованные Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов МСХ СССР.

Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов МСХ СССР, и поддерживают их периодическими пересевами через каждые 10 -15 дней.

Пригодность культуры для использования в реакции оценивают путем просмотра пробирок в проходящем свете и микроскопией.

При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в проходящем свете в среде хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании культуры посторонней микрофлорой, полная прозрачность среды – об отсутствии лептоспир.

В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5–15 дней без признаков агглютинации и лизиса (четкообразные, неподвижные клетки) с накоплением 70–100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 20X10X1,5 или 40X7–10. Культуры, содержащие 150–200 и более лептоспир в поле зрения микроскопа, разводят перед постановкой реакции питательной средой или физиологическим раствором до указанной концентрации.

Каждое разведение сыворотки разливают в отдельный ряд, состоящий из 5–13 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в три лунки с разными разведениями сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 30 °С в течение часа.

Контролем служит смесь культуры лептоспир с физиологическим раствором по 0,1 мл. Лептоспиры в контроле должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации.

4.1.8. Реакцию учитывают путем микроскопии капель из каждой лунки в темном поле микроскопа при увеличении 20X10 или 20X7X1,5. Капли из лунок выносят на предметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла. Капли можно наносить двумя способами: 1) бактериологической петлей диаметром 3 мм наносят на стекло сразу до 30 капель и затем просматривают их под микроскопом; 2) бактериологической петлей диаметром 1 мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зрения одну каплю и просматривают ее, передвигают столик на 2–3 мм и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. В этом случае на одном предметном стекле учитывают 60–80 капель.

После каждого антигена петлю прокаливают и охлаждают.

4.1.9. Результаты реакции оценивают в крестах по четырехбалльной системе:

+ + + +агглютинированы 100% лептоспир;

+ + + – агглютинированы 75% лептоспир;

+ + – – агглютинированы 50% лептоспир;

+ – – – агглютинированы 25% лептоспир;

– (знак минус) агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3–5 до нескольких десятков и даже сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность.

В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоопир, проявляющийся в набухании и обездвиживании, появлении зернистости и полного распада микробных клеток.

4.1.10. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста, при отсутствии агглютинации в 'контроле.

При повторном исследовании сыворотки крови реакцию ставят в тех же разведениях.

4.2. Порядок постановки и учета реакции макроагглютинации (РА)

Реакцию макроагглютинации ставят и учитывают в соответствии с Временным наставлением по применению антигенов для диагностики лептоспироза у животных реакцией макроагглютинации, утвержденным Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 12 мая 1974 года.

4.3. Оценка показаний РМА и РА

4.3.1. Животных с титром сыворотки в РМА 1: 100 или реагирующих по РА на 1–2 креста, кроме лошадей и крупного рогатого скота, реагирующих с лептоспирами группы Hebdomadis, считают подозреваемыми в заражении.

Крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis, и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серологической группы, считают подозреваемыми в заражении при титре антител в РМА 1: 500 или реагирующих в РА на 1–2 креста с неразведенной сывороткой.

 Скачать реферат