Новейшие генные структуры и их анализ

Введение

Часто новейшие гены, кодирующие белки одного метаболического пути или определяющие близкородственные функции, регулируются согласованно. Экспрессия таких генов начинается и заканчивается или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, объединенные в опероны, транскрибируются с промотора, находящегося на 5’-

конце такой группы генов, в виде единственной молекулы РНК, которая в дальнейшем подвергается процессу «созревания». Часть генов в хлоропластном геноме входит в состав оперонов. Это свойство они унаследовали от своих предшественников - сине-зеленых водорослей. Хлоропласты имеют также прокариотического типа трансляционную систему и характерные для бактерий регуляторные транскрипционные элементы. Однако в процессе эволюции хлоропласты приобрели и некоторые эукариотические признаки - наличие интронов в генах, процесс редактирования РНК и др.

Особенности транскрипции генов оперонов

С помощью метода run on транскрипции была изучена интенсивность транскрипции нескольких оперонов пластома ячменя. Основой транскрипционной системы служили лизированные хлоропласты, которые были выделены из первых листьев ячменя разного возраста (4-х, 9-ти и 18-ти дневные).

В ходе реакции транскрипции (длительность 10 мин) во вновь синтезированные молекулы РНК включался радиоактивно-меченный УТФ (α32P-УТФ), что позволяло в дальнейшем детектировать только вновь синтезированные транскрипты. Ограниченное время реакции практически исключает влияние процессов деградации РНК на количество синтезированных транскриптов.

Установлено, что у большинства изученных оперонов гены транскрибируются с различной интенсивностью. Наиболее равномерная транскрипция наблюдалась для rpo-оперона, содержащего rpoB-rpoC1-rpoC2 гены. Необходимо отметить, что это, вероятно, единственный оперон пластома ячменя, состоящий только из генов, кодирующих субъединицы одного белкового комплекса (субъединицы РНК-полимеразы бактериального типа). Другие опероны, также несущие большинство генов одной функциональной группы, характеризовались различиями в интенсивности транскрипции генов.

Так, у оперона rps2-atpI-atpH-atpF-atpA считывание РНК значительно повышалось (в 7-10 раз) для atpF гена по сравнению с предыдущими и последующим геном. Транскрипция гена psaB в опероне psaA-psaB-rps14 так же была интенсивнее как минимум вдвое, чем транскрипция первого и последнего генов оперона. Отмечены и значительные изменения в оперонах, содержащих гены, кодирующие компоненты различных функциональных групп хлоропластов. Так оперон atpB-atpE-trnV-ndhС-ndhK-ndhJ характеризуется значительно большей интенсивностью транскрипции генов atpB и trnV, в сравнении с другими генами (превышение в среднем не менее чем в 3 раза).

Структурно-термодинамические исследования генов

Проблема самоорганизации белков, то есть самопроизвольного сворачивания полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру, остается одной из центральных в современной молекулярной биологии и имеет три основных аспекта: структурный, термодинамический и кинетический.

Наиболее подходящими для исследования самоорганизации являются маленькие глобулярные белки, способные поддерживать нативную структуру без дополнительных факторов, таких как прочно связанные лиганды или дисульфидные мостики.

Одними из наиболее популярных объектов исследований являются изолированные SH3 домены, полученные в виде рекомбинантных белков. Ранее путем удлинения центральной β - шпильки на восемь остатков было сконструировано несколько химерных вариантов спектринового SH3-домена. Предполагалось, что такая вставка придаст β - шпильке дополнительную стабильность, и она будет выступать за пределы глобулы в виде «носа», в связи с чем эти химерные белки были названы «Бержераками». Они уже были использованы для уточнения ряда кинетических аспектов процесса самоорганизации, а в настоящее время изучаются нами в качестве удобной модели для определения термодинамических параметров образования изолированной β-структуры.

Калориметрические данные были получены нами для нескольких вариантов Бержераков в широком диапазоне pH при различных концентрациях белка. Согласно этим данным тепловое разворачивание белков происходит равновесно, обратимо и с хорошей точностью описывается моделью двух состояний при низких концентрациях белка и pH ниже 3,5. То есть выступающий нос образует с телом домена единую кооперативную систему, тепловой эффект разворачивания которой выше теплоты денатурации исходного белка в среднем на 14 кДж/моль.

С целью структурной интерпретации полученных данных методом рентгеноструктурного анализа была определена трехмерная структура одного из белков (так называемого SHH варианта), которая показала, что вставленный фрагмент действительно образует жесткую β-шпильку. В случае SHH взаимодействие этих шпилек приводит к образованию тетрамеров в процессе кристаллизации химер.

Поиск и картирование элементов геномных последовательностей

Нами разработан экспериментальный метод селекции, идентификации и картирования потенциальных энхансерных элементов внутри длинных геномных последовательностей. Предложенный метод позволяет проводить одновременный поиск всех элементов, проявляющих энхансерную активность, среди множества коротких фрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область генома.

Используемый в работе подход основан на способности энхансеров активировать промотор репортерного гена. Набор коротких фрагментов ДНК, полученных расщеплением участка длинной 1 млн. п.н. хромосомы 19 человека, был клонирован в специально сконструированный нами самоинактивирующийся ретровирусный вектор, содержащий репортерный ген неомицин-фосфотрансферазы II под контролем минимального промотора цитомегаловируса.

В дальнейшем был получен пул ретровирусных частиц, которыми инфицировали клетки линии HeLa, после чего, были отобраны неомицин-устойчивые клоны, содержащие интегрированные в геном конструкции с фрагментами ДНК, обладающими активностью энхансеров. ДНК неомицин-устойчивых клонов использовали для амплификации соответствующих фрагментов, которые затем клонировали в плазмидный вектор. Таким образом, была получена библиотека потенциальных энхансеров. Клоны библиотеки секвенировали и была построена карта расположения энхансеров в интересующем нас локусе хромосомы 19 человека. Анализ библиотеки выявил 15 энхансер-подобных последовательностей в полигенном локусе хромосомы 19 человека длинной 1 млн. п.н., энхансерная активность 13 из них была подтверждена в экспериментах по транзиентным трансфекциям с помощью системы двойной люциферазной детекции. Найденные последовательности преимущественно расположены в 5′ прилегающих к генам областях либо внутри интронов.

Анализ гена растительных изопероксидаз

Пероксидаза - один из распространенных ферментов, интерес к изучению которого с годами не ослабевает. Среди кодирующих растительных пероксидаз, образующих большое мультигенное семейство, особое место занимают патоген-индуцируемые пероксидазы, активность которых коррелирует с развитием устойчивости растений к фитопатогенам. Ранее в лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН было показано, что некоторые изопероксидазы у многих видов растений характеризуются свойством связывания с хитином.

 Скачать реферат