Группа пневмовирусов

5. Вирус центрифугируют 1 ч при 150 000 g в 10-50% -ном градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содержащие видимую зону вируса.

6. Содержащие вирус фракции объединяют, разводят NTE и обрабатывают ультразвуком. Вирус вновь центрифугируют 2 ч при 150 000 g в 20-60% -ном градиенте концентрации сахарозы.

7. Вирус концентрируют повторным центрифугированием 90 мин при 65000 g. >Данная методика позволяет получить частично очищенные препараты радиоактивно меченного РСВ. Для последующей очистки предложены более сложные методы; инфекционность, которая в обычных условиях очень чувствительна к центрифугированию, можно стабилизировать добавлением MgS04 до концентрации 1 М.

3.5.2 Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования

Данный метод требует более длительного центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы или метризамида. Растворы метризамида обладают более низкой вязкостью и осмотическим давлением, чем растворы сахарозы, и поэтому их использование для изопикнического центрифугирования предпочтительно. Растворы метризамида всегда следует готовить непосредственно перед использованием на 10 мМ HEPES, рН 7,8.

3.6 Радиоактивное мечение вирионной РНК

Интактную вирионную РНК РСВ получить трудно; рекомендуется следующая методика.

Очищенный радиоактивно меченный вирус получают, РНК экстрагируют фенолом и далее из водной фазы осаждают этанолом.

Выделенную РНК очищают центрифугированием в 15 - 30% -ном градиенте концентрации сахарозы в присутствии ДДС-Na в течение 15 ч при 19 000 об/мин.

Альтернативный подход состоит в том, что РНК, экстрагированную из немеченых вирионов, метят по З'-концу с помощью РНК-лигазы и - цитидин-3/,5'-бисфосфата, как описано Вертц и Дэвисом. РНК можно пометить и по 5'-концу после удаления 5'-концевого фосфата щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота, которую затем инактивируют протеиназой К. После этого РНК экстрагируют фенолом, осаждают этанолом и метят в присутствии - ATP и полинуклеотидкиназы из Е. coli, зараженной бактериофагом Т4. Меченую РНК затем отделяют от непрореагировавшего АТР хроматографией на колонке с сефадексом G50. Методика, удобная для мечения РНК РСВ, описана Шубертом и др. .

3.7 Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле

3.7.1 Анализ белков

Синтезированные in vivo или in vitro меченые белки можно анализировать с помощью электрофореза в 10% -ном или б - 15% -ном градиентном полиакриламидном геле, как описано Марсденом и др. .

После электрофоретического разделения в полиакриламидном геле белки можно перенести на нитроцеллюлозный фильтр для биохимического или иммунологического анализа. Применение этого метода к белкам РСВ описано Хиерхольцером и др. Перенос белков из. полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу осуществляется электрофоретически по нижеследующей методике.

1. После электрофоретического разделения белков полиак-риламидный гель помещают в камеру прибора для электрофоретического переноса вместе с листом нитроцеллюлозы. В камеру заливают буферный раствор, содержащий 0,025 М трис, 0, 193 М глицин и 20% метанола, рН 8,35.

2. Для переноса проводят электрофорез при 60 В по крайней мере 4 ч при 4°С.

3. Лист нитроцеллюлозы разрезают на полоски и помещают каждую в закрытую пробирку.

4. Полоски инкубируют с анти-РСВ сывороткой 2 ч при комнатной температуре.

5. Полоски 3 раза промывают PBS, содержащим твин 80.

6. Полоски инкубируют с конъюгатом, разведенным в 1000 раз, 3 ч при комнатной температуре.

7. Полоски 3 раза промывают тем же раствором.

8. Нитроцеллюлозу проявляют раствором, содержащим 50 мг 3,3'-диаминобензидина и 100 мкл 3% -ной перекиси водорода в 100 мл PBS, рН 7,2.

9. Нитроцеллюлозу промывают водой и сушат на листе фильтровальной бумаги.

10. Количественный анализ можно провести спектрофотометрически после обработки нитроцеллюлозы веществами, растворяющими пластмассы. В результате подобной обработки нитроцеллюлоза становится прозрачной.

3.7.2 Анализ РНК

Радиоактивно меченную РНК из очищенных вирионов или из цитоплазмы зараженных РСВ клеток можно проанализировать электрофорезом в 1,5% -ном геле агарозы, содержащем 6 М мочевину, по следующей методике.

1. Для приготовления геля размером 50X17X0,3 см готовят отдельно следующие растворы: а) 120 мл 4,5% -ной агарозы; для растворения агарозы суспензию обрабатывают в микроволновой печи или автоклавируют ее; б) 1,5-кратный концентрат раствора мочевины в цитратном буфере; для этого к 129,6 г мочевины добавляют 9 мл концентрированного 1 М цитратного буфера и растворяют, доводя объем водой до 240 мл.

2.1,5-кратный буфер нагревают и смешивают с 3-кратным концентратом агарозы.

3. Гель заливают на холоду в горизонтальный аппарат для электрофореза в 3 стадии, перерывы между стадиями составляют 45 мин.

4. В гель немедленно вводят гребенку.

5. Гель используют для электрофореза через 2-3 ч после заливки. Гребенку вынимают, промывают ячейки буфером с мочевиной и заполняют их тем же буфером. В ячейки вносят образцы, смешанные с буфером для нанесения.

6. Электрофорез проводят на холоду при градиенте напряжения 5 В/см в течение 18 ч. Основные растворы готовят следующим образом.

1 М цитратный буфер, рН 3,0: смешивают 1 М растворы лимонной кислоты и цитрата натрия до достижения рН 3,0. Буфер для электрофореза: 1 М. цитратный буфер разводят в 40 раз, получая 0,025 М цитратный буфер, рН 3,0 Буфер для нанесения образцов: 0,025 мл 1 М цитратного буфера, 3,6 г 6 М мочевины, 2 г 20% -ной сахарозы, 0,1 мл 0,005% -ного бромфенолового синего, объем доводят водой до 10 мл. Буфер с 6 М мочевиной: 3,6 г мочевины, 0,25 мл 1 М цитрата, рН 3,0; объем доводят до 10 мл дистиллированной водой.

3.8 Очистка матричной РНК для трансляции

Матричную РНК для трансляции in vitro получают следующим образом.

1. 50-Ю6 клеток заражают РСВ. Клетки инкубируют 10-12 ч при 37 °С.

2. Монослой промывают, снимают клетки со стекла и суспендируют в буферном растворе. Суспензию оставляют на 10 мин при 4°С для набухания клеток.

3. Клетки разрушают в гомогенизаторе Даунса, затем осаждают клеточный и дебрис центрифугированием при 4°С.;

4. Осадок ресуспендируют в 2 мл того же буфера, вновь гомогенизируют и центрифугируют. Супернатанты, полученные после первого и второго центрифугирований, объединяют.

5. К супернатанту добавляют CsCl и N-лаурилсаркозин. Раствор тщательно перемешивают и прогревают 1-2 мин при 51 °С.

6. 7 мл полученного раствора наслаивают на 2 мл раствора в пробирке для ротора SW40 и добавляют сверху буфер, чтобы заполнить пробирку. Пробирки центрифугируют в роторе SW40 16 ч при 25000 об/мин и 25 °С.

7. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды. РНК дважды переосаждают этанолом, добавляя 1,2 мл этанола, 25 мкл 4 М раствора NaCl и 10 мкл 10% -ного ДДС-Na.

8. После второго осаждения осадок ресуспендируют в буфере, добавляют ДДС-Na до концентрации 0,2% и проводят хроматографию на колонке с олиго - целлюлозой. Связавшийся материал элюируют и осаждают РНК этанолом, добавляя в ка* честве носителя тРНК из печени кролика. Осадок ресуспендируют в том же буфере без ДДС-Na и переосаждают РНК двумя объемами этанола в присутствии 0,2 М ацетата калия. Конечный осадок ресуспендируют в 250-500 мкл 0,01 М HEPES, рН 7,6. В качестве бесклеточной системы для синтеза белка можно использовать зависимый от мРНК лизат ретикулоцитов кролика, приготовленный, как описано Престоном, или коммерческий препарат лизата. Для контроля следует параллельно получить мРНК из незараженных клеток. Индивидуальные вирусные мРНК для трансляции в бесклеточной системе можно выделить методом гибридизационной селекции с использованием клонов кДНК с известной структурой, как описано Коллинзом и Вертц.

 Скачать реферат