Группа пневмовирусов

Содержание

1. Уникальные особенности пневмовирусов

1.1 Общее введение

1.2 Номенклатура

1.3 Выделение вируса

1.4 Хранение вируса

2. Основные методы

2.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса

2.1.1 Чувствительные культуры клеток

2.1.2 Цитопатогенное действие

2.1.3 Методы повышения инфекционное ™

2.1.4 Методы стабилизации инфекционное

2

.2 Методы определения инфекционности

2.3 Гемагглютинация

2.4 Гемадсорбция

2.5 Иммунофлуоресцентные методы

2.6 Твердофазный иммуноферментный анализ

3. Аналитические методы

3.1 Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация

3.1.1 Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках

3.1.2 Радиоиммуноанализ

3.1.3 Радиоиммунопреципитация

3.2 Метод выявления дефектных интерферирующих частиц

3.3 Электронная микроскопия

3.3.1 Морфология вирионов

3.3.2 Морфогенез вирионов

3.3.3 Сканирующая электронная микроскопия

3.3.4 Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков

3.4 Концентрирование вируса

3.5 Очистка и радиоактивное мечение РСВ

3.5.1 Градиентное центрифугирование

3.5.2 Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования

3.6 Радиоактивное мечение вирионной РНК

3.7 Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле

3.7.1 Анализ белков

3.7.2 Анализ РНК

3.8 Очистка матричной РНК для трансляции

3.9 Молекулярное клонирование и олигонуклеотидное секвенирование

3.10 Очистка вирусных белков

3.10.1 Вирусные полипептиды

3.10.2 Очистка капсидного белка

3.10.3 Очистка вирионных гликопротеинов

4. Специальные биологические методы

4.1 Получение моноклональных антител

4.2 Выделение температурно-чувствительных мутантов

4.3 Получение персистентно инфицированных клеточных культур

1. Уникальные особенности пневмовирусов

1.1 Общее введение

В состав группы пневмовирусов входят респираторно-синцитиальный вирус человека, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота и вирус пневмонии мышей. Прототип этой группы, респираторно-синцитиальный вирус, - это плеоморфный оболочечный вирус, геном которого представлен несегментированной РНК негативной полярности. РСВ принадлежит роду Pneumovirus, который вместе с родами Paramyxovirus и Morbillivirus образует семейство Paramyxoviridae. Однозначно доказана этиологическая роль РСВ при ежегодных вспышках респираторных заболеваний у детей. Уникальность биологических, биохимических и клинических характеристик этого вируса не позволяет объединить его с представителями рода Paramyxovirus. РСВ обнаруживают у сельскохозяйственных животных; РСВ крупного рогатого скота вызывает у животных респираторное заболевание. Антитела к РСВ часто присутствуют и в сыворотке крови других домашних и лабораторных животных, контактирующих с человеком, но выделение вируса от этих животных не описано. Изоляты РСВ, выделенные от человека и крупного рогатого скота, имеют антигенное родство; среди человеческих изолятов не обнаружена связь между антигенной вариабельностью и клиникой заболеваний. Вирус пневмонии мышей, вызывающий у этих животных респираторное заболевание, не имеет антигенного родства с РСВ, однако в некоторой степени сходен с ним; во всяком случае это единственный вирус, достаточно близкий к РСВ, чтобы быть включенным в род Pneumovirus. Антитела к ВПМ с высокой частотой обнаруживаются в сыворотке крови человека; имеются неопубликованные данные, указывающие на то, что в лабораторные колонии мышей этот вирус попал от человека.

Основные свойства РСВ приведены в табл.1. РСВ отличается от других парамиксовирусов большим числом идентифицированных белков, порядком генов (имеются два гена неструктурных белков, один из которых расположен между З'-концевой лидерной последовательностью и геном нуклеопротеина, а другой - между гипотетическими генами гликопротеинов F и G), отсутствием гемагглютинина и нейраминидазы, а также характерными размерами нуклеокапсида и поверхностных выступов.

Таблица 1. Общие свойства пневмовирусов

1.2 Номенклатура

В англоязычной литературе для обозначения респираторно-синцитиального вируса имеет смысл использовать сокращение RS-вирус, а не RSV, чтобы отличать его от вируса саркомы Рауса, типичного представителя ретровирусов. Кроме того, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота следует отличать от не родственного ему синцитий-образующего вируса, также относящегося к ретровирусам.

1.3 Выделение вируса

В связи с необычной лабильностью РСВ и низким титром в секретах и зараженных тканях при выделении этого вируса требуется особая тщательность. Попытки выделения вируса из хранившихся образцов редко бывают успешными. Имеет смысл доставлять чувствительную культуру клеток непосредственно к месту нахождения пациента или зараженного животного, а не транспортировать содержащие вирус материалы в лабораторию для заражения культуры.

Чаще всего для выделения РСВ используют линии клеток Нер-2 и HeLa, однако описано использование культуры почек макак-резусов, линий BS-C-I, MRC-5, WI-38 и некоторых других. Лучшим материалом для выделения РСВ служат смывы слизистой носа или носоглотки больных детей. Смывы можно перенести в пробирку с небольшим количеством буферного раствора или бульона. Содержимое пробирок перемешивают энергичным встряхиванием. Образцы следует держать в ледяной бане и как можно скорее использовать для заражения чувствительной культуры клеток. Во всяком случае, промежуток между сбором материала и заражением культуры не должен превышать нескольких часов. Из антибиотиков наиболее часто используют пенициллин ', стрептомицин, неомицин и микостатин.

 Скачать реферат