Микроскопическое исследование древесины и целлюлозных волокон

Получение срезов древесины на микро- или ультрамикротоме требует сложных методов фиксации и резки материала Подготовка срезов состоит в последовательном проведении следующих операций: обезвоживания; пропитки; полимеризации; заточки блока; изготовления ножа; резки; освобождения от полимеризата; окраски; промывки; фиксации. Этот метод используют главным образом для приготовления ультратонких срез

ов для электронной микроскопии. Для изготовления срезов древесины вручную применяют опасную бритву, имеющую одну совершенно плоскую сторону, без выемки или лезвия безопасной бритвы. Исследуемый образец древесины цилиндрической или прямоугольной формы вырезают из кусочка ствола острым ножом или скальпелем. Перед резкой образец древесины кипятят в течение 30 мин, а иногда и нескольких часов в воде с последующим переносом его в холодную воду или остыванием в том же сосуде, в котором проводилось кипячение. Это необходимо для удаления из древесины пузырьков воздуха и получения образца с определенной твердостью. Свежесрубленная древесина в большинстве случаев режется без всякой подготовки, но при этом ее необходимо держать в воде. Фиксированные образцы тщательно промывают водой в течение некоторого времени, чтобы удалить фиксирующий материал.

Образец мокрой древесины помещают между двумя кусочками пробки или бузины и для образования ровной поверхности срезают древесину острым ножом. Затем поверхность древесины смачивают водой и осторожно с нее снимают бритвой слои вместе с пробкой. Бритву также все время смачивают водой или спиртом, держат наискось, плоской стороной вниз, острием от себя и протягивают через объект скользящим движением, свободно и легко. Нельзя при этом прижимать локти к туловищу или опираться ими на стол, так как это лишит руки свободы движения. Если бритва врезалась в древесину слишком глубоко, лучше вынуть ее во избежание поломки. Срезы должны получаться очень маленькими и совсем прозрачными. Полученные срезы снимают с лезвия очень осторожно мягкой кисточкой, переложив бритву в левую руку и не выпуская объект. Для проверки качества срезы переносят в заранее приготовленную каплю воды на предметном стекле и просматривают при малом увеличении микроскопа. Если срезы плохие, то их выбрасывают и делают новые.

Следует отметить, что приготовление срезов вручную требует известного навыка и умения владения опасной бритвой, чтобы получить с ее помощью удовлетворительные срезы. Необходимо бережно обращаться с бритвой, постоянно точить и править ее, оберегать от ударов и реактивов, держать сухой и закрытой.

Подготовка препаратов. Из полученных срезов готовят временные или постоянные препараты. Изучать древесину и целлюлозные материалы с помощью микроскопа через воздушную прослойку нецелесообразно, так как вследствие отражения лучей света от боковых частей материала его контуры будут видны очерченными слишком темными линиями. Поэтому исследуемый материал заключают в какую-либо жидкость, которая уменьшает отражение лучей и увеличивает прозрачность.

Для более контрастного выявления особенностей строения анатомических элементов на срезах древесины до заключения их в ту или иную среду проводят окрашивание. Наиболее часто для окраски применяют 1%-ный водный раствор сафранина или комбинацию красителей: сафранин и водный синий; хризоидин и водный синий либо светлый зеленый. Срезы помещают в ванночку с красителем и выдерживают в нем в течение 5 мин, затем избыток красителя отмывают водой, глицерином или спиртом.

Приготовление временных препаратов. Каплю воды наносят пипеткой или стеклянной палочкой на середину чистого сухого предметного стекла, препаровальными иглами переносят в нее срез и накрывают покровным стеклом. Покровное стекло прикладывают к предметному под острым углом так, чтобы оно касалось края капли; после этого его осторожно опускают. Капли жидкости, выступающие по краям покровного стекла, удаляют слегка смоченной фильтровальной бумагой, подводя ее к одному краю покровного стекла. Если жидкости под стеклом мало, ее добавляют, приподняв покровное стекло, или наносят каплю воды вплотную к краю покровного стекла. При резком опускании покровного стекла в жидкости остаются пузырьки воздуха, заметные под микроскопом, в виде черных резко очерченных кружков, которые мешают изучению объекта в микроскопе.

Временные препараты могут быть использованы для исследований только на одном занятии. Долго сохранять их невозможно, так как вода быстро испаряется.

Приготовление постоянных препаратов. Для сохранения препарата в течение длительного времени окрашенные срезы древесины заключают не в воду, а в глицерин-желатиновую смесь или в пихтовый бальзам. Перед заделкой срезы обезвоживают.

В случае приготовления глицерин-желатиновых препаратов воду и избыток красителя из срезов удаляют тщательной промывкой глицерином с его отсасыванием. Эту операцию можно проводить на воронке фильтрующей обратной типа ВФОТ диаметром 10 .20 мм. После этого срезы заключают в глицерин-желатину.

Глицерин-желатину стеклянной палочкой наносят на срез, предварительно помещенный на предметное стекло. Чтобы глицерин-желатина сразу не застыла на холодном предметном стекле, его слегка подогревают на спиртовке. На теплую каплю накладывают покровное стекло, также прогретое на пламени спиртовки, и кончиком иглы осторожно придавливают стекло, равномерно распределяя глицерин-желатину. Когда среда остынет, края покровного стекла можно обвести лаком, чтобы предотвратить высыхание желатины. Этот способ приготовления препаратов достаточно простой, но срезы со временем обесцвечиваются.

Для заключения среза в бальзам процесс обезвоживания осуществляется значительно сложнее, так как ксилол, в котором растворен бальзам, совершенно не смешивается с водой. Вода, оставшаяся в срезе, образует муть. Обезвоживание проводят водным этанолом восходящей концентрации: 40%-ным в течение I мин; 70 и 96%-ми — по 2 мин. Для удаления последних следов воды срез обрабатывают двумя каплями фенол-ксилола в течение 2 .3 мин и после просветления для удаления фенола срез промывают в чистом ксилоле.

Для заключения препарата в бальзам одну-две капли его раствора в ксилоле наносят стеклянной палочкой на срез и накладывают покровное стекло. Слегка надавливая на покровное стекло препаровальной иглой, удаляют из под него избыток бальзама и пузырьки воздуха. Выступивший вокруг покровного стекла бальзам удаляют нагретым копьецом или перочинным ножом. Через несколько дней бальзам у краев стекла подсохнет и препарат может быть окончательно вычищен бензином.

Все операции по заключению в бальзам и глицерин-желатину могут быть проведены непосредственно на предметном стекле. Обычно на одно предметное стекло помещают рядом три среза: поперечный срез располагают слева, а продольные — справа один под другим. За ходом обработки следят при малом увеличении микроскопа или в штативной лупе, не покрывая срезы покровным стеклом. Готовые постоянные препараты хранят в коробочках в вертикальном положении.

Методика мацерации древесной ткани. Мацерацию древесной ткани осуществляют разрушением межклеточного вещества в результате делигнификации сильными окислителями. Наиболее часто в качестве окислителей используют 10 или 20%-ные растворы хромовой кислоты или концентрированную азотную кислоту с добавлением небольшого количества хлората калия.

 Скачать реферат