Технология рекультивации нефтезагрязнённых земель на основе аборигенных штаммов

3.1 Материал и методика получения препарата

Отбор проб, маркировка (ТО-2-1)

Основные операции по отбору проб осуществляются согласно ГОСТ 17.4.3. 01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

Подготовительные работы включают подготовку лабораторной посуды, упаковочных материалов, инструментов для отбора образцов грунта. Она включает следующие операции: >- готовят пакеты из плотной бумаги и стерилизуют их; загрязненные пробы отбирают в новые полиэтиленовые пакеты;

- готовят инструменты для отбора проб: лопаточки, совки, бур, а также этикетки. На этикетках указывается место и дата отбора пробы, фамилия отобравшего, давность загрязнения почвогрунтов нефтью, фамилия ответственного за проведение исследования. Транспортировка и хранение отобранных проб осуществляется при температуре 0-4 °С, возможно временное хранение при температуре, не превышающей 25 °С в течение непродолжительного времени - 24 часа.

3.2 Выделение бактерий-деструкторов из загрязненных объектов методом накопительных культур (ТП-3)

Постановка накопительных культур (ТО-3-1)

Выделение бактерий методом накопительных культур осуществляется в несколько этапов:

- постановка накопительных культур;

- выделение чистых культур.

Подготовительные операции. Готовят питательную плотную среду на гидролизате рыбной муки. Среда готовится согласно прописи, указанной на этикетке. Среду расплавляют, разливают в чашки Петри по 12-15 см3 , после застывания агара чашки переворачивают вверх дном, хранят при комнатной температуре.

Готовят жидкую солевую среду следующего состава:

КNО3 -1г;

КН2РО4 -1г;

K2НРO4 -1г;

MgSO4 -0,2 г;

СаСl2 -0,02 г;

FeCl3 -0,002 г;

Объем водопроводной воды доводится до 1 литра.

В качестве единственного источника углерода в накопительной культуре используют сырую, предварительно простерилизованную нефть того месторождения, в районе которого отобраны образцы почвы.

Стерилизацию сырой нефти осуществляют следующим образом: сырую нефть разливают в высокие узкие бутылки по 200-300 см3, закрывают ватно-марлевыми пробками, помещают в водяную кипящую баню, выдерживают в течение 30-40 минут. Такую операцию повторяют трижды с интервалом в трое суток.

Перед постановкой накопительной культуры готовят образцы загрязненной почвы. Их доводят до воздушно-сухого состояния, измельчают, выбирают мелкие камешки, растительные остатки и перемешивают. Из образца отбирают пробу в количестве двух грамм, переносят ее в стерильную фарфоровую ступку, куда добавляют (мерно) небольшое количество солевой среды. Увлажненную пробу растирают в течение 30-40 минут. После этого содержимое помещают в колбу, ступку и пестик несколько раз споласкивают солевой средой, перенося жидкость в ту же колбу, доводят общий объем суспензии в сосуде до 200 см3.

В колбы с почвенной болтушкой вносят 2 см3 стерильной нефти, колбы встряхивают, оставляют на сутки в статических условиях, затем помещают на шуттель на 72 часа. Весь процесс культивирования ведется при температуре 22-24 °С. Через четверо суток, отмечаются видимые изменения в системе жидкой фазы - помутнение среды, появление пигмента и слоя нефти (дезинтеграция слоя, расслоение, изменение цвета, появление продуктов омыления и др.).

3.3 Мелкосерийное производство препарата (ТП 6)

Получение маточной культуры (ТО-6-1)

Для получения маточных культур используют агаровые культуры аборигенных бактерий, выделенных на стадии ТП-3. Эти культуры являются посевным материалом, используемым для засева в ферментеры.

Для каждого бактериального изолята, являющегося на данном этапе производственным штаммом, готовят отдельный посевной материал и проводят культивирование в отдельном ферментере. При этом учитываются индивидуальные видовые и штаммовые особенности бактериального деструктора. Для получения маточной культуры используют минеральную среду, указанную в ТО-3-1. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды.

Культуры изолятов, выращенные на скошенном агаре, основой которого является гидролизат рыбной муки (ТО-3-1), смывают физиологическим раствором, готовят суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять не менее 10 х 109 м. кл. х см3, объем - не менее 25-50 см3.

3.4 Выращивание посевного материала в колбах

Питательную солевую среду того же состава разливают по 150 см3 в колбы вместимостью 500 см3, в среду засевают 15-25 см3 бактериальной суспензии, приготовленной на стадии ТО 6-1. Туда же вносят 1,5 см стерильной нефти. Посевы в колбах инкубируют в УВМТ в течение 72 часов при 200-220 об/мин., температуре выращивания 29±1 °C. Полученную маточную культуру контролируют:

- концентрация живых микробных клеток должна составлять для культур различной таксономической принадлежности от 2 до 5 х 109 м. кл. х см-3, но не менее 1 х 109 м.кл. (метод определения колонеобразующих клеток методом высева на плотные среды КОЕ);

- микроскопия культуры. Устанавливается типичность морфологической картины в препарате и ее соответствие признакам, отраженным в паспортных характеристиках на штамм;

- наличие посторонней микрофлоры - не допускается.

3.5 Процесс наработки биопрепарата на объектах

Получение культуральной жидкости в ферментерах МФ-250 или МФ-300.

Для наработки биопрепарата на объектах в объемах, необходимых для обработки нефтезагрязненных участков земли, проводят глубинное культивирование в ферментерах МФ-250 (МФ-300).

Машина ферментационная МФ-250 (МФ-300) позволяет нарабатывать 200 (250) литров концентрированного препарата за 1 цикл культивирования.

В качестве единственного источника углерода используют дизельное топливо и сырую стерильную нефть, количество в ферментационной жидкости составляет не менее 1% (по объему). Процесс глубинного культивирования проводят при интенсивном перемешивании и постоянной подаче сжатого стерильного воздуха, обеспечивая массообмен на уровне газ - жидкость в пределах 3 мМоль/л х мин-7 при температуре 28-30 °С в течение 36-48 часов.

В процессе культивирования с помощью специальных приборов МФ-250 контролируют температуру ведения ферментации, режим аэрации и рН, а также развитие культуры методом микроскопирования препарата ферментационной жидкости и накопление биомассы (методом КОЕ на 12 час культивирования, а также через каждые 6 часов). Корректировку рН ведут до значений (7,0±0,2) ед. рН введением раствора аммиака.

Помимо общей технологии наработки культуральной жидкости существуют ещё несколько специально разработанных для повышения выхода продукта.

Культуральная жидкость - это суспензия, содержащая высокую концетрацию микробных клеток, включающая остаточные компоненты питательной среды и продукты метаболизма (жизнедеятельности клеток).

Микробные клетки - это один или несколько очищенных и активизированных аборигенных штаммов микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязнённых почв вахтовых объектов подлежащих очистке.

Посевной материал - это приготовленный в лаборатории препарат, полученный из выделенных и активизированных аборигенных штаммов, который должен соответствовать следующим нормам.

 Скачать реферат