Патоморфологическая диагностика висцеральных микозов

Гистохимическими исследованиями выделяли гликоген постановкой ШИК – реакции, липиды Суданом черным В, железо окраской по Перлсу. Кроме того, проводили окраску хроматофильного вещества и ядер нервных клеток по Нисслю. Выполняли гистологическое исследование изготовленных препаратов с подробным протоколированием и фотографированием участков с отклонениями от нормы.

Кроме того, изучали патоморф

ологические изменения в органах при экспериментальном заражении животных и возможность возникновения изменений в хромосомном аппарате кроликов, под влиянием грибов Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia на хромосомный аппарат подопытных животных путем кариологического анализа клеток красного костного мозга, находящихся в стадии метафазы.

В эксперименте было использовано 45 кроликов породы советская шиншилла в возрасте 5 месяцев, отобранных по методу аналогов, учитывая такие показатели, как порода, пол, возраст, масса тела, условия кормления и содержания.

Было проведено четыре опыта по изучению влияния воздействия грибов Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia на животных.

Контролем служили взрослые кролики того же возраста.

Заражение проходило при введении в ушную вену суспензии конидий гриба, выделенных из пораженных органов спонтанно заболевших и павших животных.

Костный мозг получали из трубчатых костей бедра и голени непосредственно перед убоем.

Приготовление препарата для хромосомного анализа осуществляли по методу С.С. Бирбина (1970).

1. В 10 мл раствора Хенкса (без бикарбоната), подогретого до 38°С, содержащего 0,1 мг колхицина, 300 ЕД гепарина, 0,6 мл буферного двухосновного фосфата натрия, вносили 0,5 – 1,0 мл костного мозга, приготавливали суспензию, инкубировали ее 30 – 60 минут при температуре 38°С. Затем центрифугировали 10 минут при 1000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость осторожно удаляли.

2. К полученному осадку добавляли 10 мл 0,9% раствора лимоннокислого натра подогретого до 38°С, осадок собирали пипеткой и помещали в термостат при температуре 2 градуса по Цельсию. Затем пробирки ставили в центрифугу на 15 минут при 1000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость удаляли.

3. К осадку по стенке осторожно добавляли 1,5 – 3,0 мл свежеприготовленного охлажденного до 4°С фиксатора, состоящего из трех частей метанола и одной части ледяной уксусной кислоты. Осадок, не встряхивая, выдерживали в фиксаторе 10 минут, жидкость осторожно удаляли, а осадок суспензировали новой порцией фиксатора. Пробирки помещали в холодильник на 30 – 60 минут, после чего суспензию центрифугировали 3 минуты при 800 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляли, пробирки опрокидывали для лучшего стекания фиксатора. Со стенок пробирок остатки жидкости снимали ватным тампоном.

4. Осадок суспензировали в новой порции фиксатора, центрифугировали 3 минуты при 800 оборотов в минуту и надосадочную жидкость удаляли. Аналогичную манипуляцию повторили дважды.

5. К осадку добавили новую порцию фиксатора, равномерно суспензировали и готовили препараты путем выжигания фиксатора. Для этого на предметное стекло наносили 2 – 3 капли суспензии и после незначительного растекания ее поджигали от пламени спиртовки.

Препараты окрашивали азур - эозином по Нохту.

В рабочий раствор на 100 мл дистиллированной воды добавляли 1 мл буферного раствора двухосновного фосфата натрия (18,814 г фосфата на 100 мл воды). Препараты проводили через ксилол и заключали в канадский бальзам.

Для просмотра метафазных пластинок из делящихся клеток костного мозга использовали малое увеличение микроскопа. Их анализ проводили под иммерсией: учитывали размеры, форму хромосом, расположение центромер, подсчитывали количество хромосом. Всего проанализировано 100 метафазных пластинок от контрольных и подопытных животных.

Для изучения чувствительности цыплят к грибам Candida, выделенным из пораженных органов и фекалий больных кандидозом телят, было поставлено несколько опытов на 114 цыплятах.

Опыт № 1. Заражение культурой Candida albicans, выделенной из пораженного рубца теленка в возрасте 14 дней.

Культуру в виде суспензии выпаивали 2-х дневным цыплятам 1 раз в сутки 5 дней подряд. Часть цыплят убивали через каждые 2 дня.

Опыт № 2. Заражение несколькими штаммами грибов Candida, из которых были: C. albicans, C. krusei, C. parakrusei, C. рseudotropicalis, C. tenuis, выделенные из фекалий телят.

Заражали 5 групп цыплят отдельно каждым штаммом, скармливали зараженный корм в отдельных кормушках, но кормили и содержали в одном месте.

Опыт № 3. Заражение сочетанием грибов Candida albicans и Aspergillus fumigatus, выделенных из пораженного рубца (Candida) и легких (Aspergillus fumigatus) павшего теленка.

Заражали 3 группы цыплят. Одной группе выпаивали суспензию Candida albicans, второй - Aspergillus fumigatus и третьей - сочетание этих двух видов грибов.

При подозрении на кандидоз высевы фекалий делали с помощью шпателя, растирая материал по поверхности пластинчатого агара. Но этот метод не оказался приемлемым при высевах фекалий телят с подозрением на поражение плесневыми грибами. Эти виды грибов обычно быстро покрывают поверхность агара, вследствие чего не представляется возможным исключить загрязнение в момент высева, тем более, если колонии бывают единичными. При подозрении, по результатам бактериоскопии, на смешанный микоз, высевы фекалий мы делали также капельным методом, который позволял не только исключать загрязнение, но и более четко идентифицировать вырастающие колонии грибов. Если рост колоний грибов появлялся на агаре между нанесенными каплями материала, то эти колонии расценивались как загрязнение. Если же колонии грибов появлялись на капле нанесённых фекалий, то они принимались во внимание, а данный гриб расценивался как возбудитель заболевания только при условии, что бактериоскопия фекалий покажет мицелиальные формы гриба.

Для изучения влияния сыворотки молозива коров, содержащей и не содержащей противогрибковые антитела, на возникновение и развитие висцерального кандидоза, получали сыворотку, выдаивая молозиво коров в колбу, куда предварительно насыпали 0,5 г порошка химозина или наливали 1% раствор пепсина из расчета 10 мл на 100 мл молозива. Смесь выдерживали в теплом месте или в термостате при 37°С 6-12 часов. Появившуюся сыворотку отделяли фильтрованием через бумажный фильтр и затем исследовали её по РА пластинчатым и пробирочным методами на наличие антител против грибов Candida.

В качестве антигена использовали суспензию смыва 48 часовой культуры гриба Candida на физиологическом растворе с концентрацией 1 млрд. спор гриба в 1 мл.

В опытах использовали молодых морских свинок, подобранных по методу аналогов (возраст -2,5 месяца, вес - 350-400 г).

Противогрибковые свойства сыворотки молозива изучали, выпаивая её одновременно с заражением и через 7 дней после заражения, т.е. к моменту развившегося заболевания.

Заражали морских свинок суспензией гриба Candida albicans 5 дней подряд, один раз в день по 1 мл (1 млрд. клеток), путем выпаивания при помощи глазной пипетки или нанесения шпателем в защечную область агаровой культуры (6-7 колоний гриба). Одновременно задавали антибиотик (биомицин) по 25 мг один раз в день для усиления патогенного действия грибов.

 Скачать реферат