419 Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья

Ряд авторов /12/ отмечают также, что «молодые» бактериальные клетки, выращенные на полноценной питательной среде, Устойчивее к действию ДСН, чем клетки более поздней фазы роста. Существенное значение также заряд клеточной поверхности. При щелочном значении рН на поверхности клетки уменьшается число положительно заряженных групп, в соответствии с этим снижается и количество сорбированного на пов

ерхности ПАВ за счет электростатического притяжения гидрофильной части молекулы ДСН, несущей отрицательный заряд. Вследствие этого количество ПАВ на поверхности обусловлено теми гидрофобными участками, с которыми взаимодействует алкильная часть молекулы ДСН. Таким образом, ПАВ способны взаимодействовать с различными компонентами клеточных стенок бактерий, включая муреиновый слой, белки, липиды, липопротеины, липолисахариды. Проникновение ПАВ внутрь клеток, если оно затруднено пространственными или электростатическими факторами, может происходить и через поры. Существенную роль в устойчивости микроорганизмов к действию детергентов играет «электростатическое экранирование», обусловленное наличием заряженных функциональных групп на поверхности их клеток, а также присутствием ионов металлов в среде /5/.

Рассмотрим общую характеристику мембран. На электронных микрофотографиях ультратонких срезов клеток бактериальная клеточная мембрана выглядит как двойная линия шириной около 8 нм. Она состоит из двух слоев фосфолипидов, в которые включены мембранные белки. Самой перспективной и наиболее убедительно трактующей современные экспериментальные данные считается метаморфно-жидкостно-мозаичная модель структуры мембраны. С ее помощью объясняется и присутствие в мембранах белков двух типов: периферических и интегральных. Первые переходят в надосадочную жидкость при отмывании мембран буферными растворами с различными значениями рН или ионной силы. Вторые – внутренние белки, сохраняющие связь с мембранами после проведения перечисленных операций и освобождающиеся только после разрушения фосфолипидного бислоя. Следует отметить, что обычно интегральные белки имеют амфифильную природу и способны к самоагрегации в водных растворах. Большая часть мембранных белков бактерий является белками-переносчиками и ферментами, ответственными за биосинтез макромолекул. В настоящее время известно около 20 различных белков бактериальных внешних мембран, некоторые из них синтезируются в больших количествах. ПАВ является уникальным инструментом для для извлечения белков из бактериальных мембран /12/.

Принципиальное сходство в действии НПАВ и АПАВ свидетельствует о том, что главным агентом фрагментациимембраны являются не заряженные гидрофильные группы детергента, а гидрофобная часть молекулы. Отсюда следует, что мицелла, соприкоснувшись с поверхностью мембраны, вероятно, изменяет свою конфигурацию, обнажая гидрофобные группы. В такой форме ПАВ взаимодействует с мембраной, главным образом за счет неполярной гидрофобной части молекул, что, по-видимому, сопровождается солюбилизацией ПАВ в гидрофобных участках мембраны. При этом последняя дробится на более или менее крупные липопротеидные фрагменты, солюбилизированные благодаря присутствию в них ПАВ /13/.

Связывание детергента с мембраной зависит от числа связывающих мест и от степени их сродства к молекулам детергента. Число мест связывания при высоком уровне сродства невелико, что, в свою очередь, слабо влияет на конформацию мембранных белков. С увеличением концентрации детергента постепенно начинают насыщать места связывания с высоким сродством к детергенту. Этим объясняется «мягкое» воздействие НПАВ на мембраны, так как значения их концентрации мицеллообразования (ККМ) ниже, чем в случае АПАВ. При изучении последовательности действий КПАВ на цитоплазматические мембраны стрептококков установлено, что в первую очередь изменяется проницаемость мембран. Этим обусловлено нарушение тех функций мембран, которые зависят от их нативной проницаемости – транспорта веществ и преобразования энергии. Действие более высоких концентраций КПАВ сопровождается солюбилизацией белковых и липидных компонентов мембран, изменением вторичной структуры белков и инактивацией их ферментных систем. Нарушение проницаемости мембран стрептококков под влиянием катионных детергентов определяется действием этих соединений на липидные компоненты мембран, что приводит к изменению структурной организации их гидрофобной области /14/.

Установлено, что КПАВ действуют на фосфолипидные компоненты мембран протопластов у стрептококков, лизис которых является результатом вторичных осмотических явлений. АПАВ, наоборот, воздействует на белковые компоненты мембран. В результате ингибирования лизиса протопластов после предварительной обработки последних ионами уранила подтверждена важная роль фосфатных групп в механизме действия ПАВ на мембрану. Предполагается, что АПАВ и КПАВ действуют на различные участки мембраны или на один и тот же участок, но различными путями. В ряду алкилсульфатов натрия ДСН обладает наибольшей литической активностью по отношению к ЦПМ протопластов дрожжей. Ряд специалистов полагают, что сорбция ионов ПАВ происходит главным образом на мембранных компонентах липидной природы, а взаимодействие с участием белковых компонентов мембраны /15/.

Советский ученый В.А. Тукмачев предложил модель действия ПАВ на мембраны, согласно которой иго ион (или молекула) сорбируется на мембране, внедряясь в нее своей липофильной частью, и действует на мембранное окружение по принципу клина. При сорбции на мембране определенного количества ионов (или молекул) ПАВ прочность мембраны резко падает, в результате чего она разрушается. Взаимодействие гидрофильных групп с мембранным окружением в этой модели не учитывается. Предполагается, что в литическом процессе это взаимодействие играет второстепенную роль. Е. Фриз (Швеция) предложил следующий механизм взаимодействия ПАВ и мембраны /8/.

1. Связывание детергента без интеграции. При низких концентрациях молекулы ПАВ связываются с мембраной, вероятно, в результате вторжения во внешний слой липидного бислоя.

2. Лизис. Как только концентрация свободного мономера ПАВ достигает определенного уровня, присутствующие молекулы ПАВ дестабилизируют мембрану.

3. Диссоциация мембраны в раствор. При высокой концентрации раствора вся мембрана оказывается окруженной молекулами ПАВ, и дальнейшее их добавление приводит к смене фаз: мембраны перестраиваются в смешанные мицеллы, содержащие детергент-липидные или детергент-белковые комплексы.

4. Освобождение белков от липидов. С увеличением концентрации добавляемого ПАВ количество липидов уменьшается до тех пор, пока все белки не освободятся от них. Экспериментальное подтверждение выдвинутой гипотезы в отношении механизма действия ПАВ было получено при изучении влияния дезоксихолата натрия (ДОХ) на вирус леса Семлики. Так, при концентрации ПАВ 1,5 мМ наблюдалось разрушение вируса и одновременное высвобождение липидов и белков; при 2 мМ ДОХ все мембранные белки освобождались от липидов и образовывали комплексы больших размеров. Увеличение содержания детергента до 5 мМ приводило к возрастанию размеров безлипидных белковых комплексов. Аналогичные результаты получены при действии на этот объект тритона Х-100 и ДСН; различными были лишь концентрации ПАВ, приводившие к одинаковому эффекту.

 Скачать реферат