419 Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья

До настоящего времени окончательно не установлено существование стабильных иРНК, специфичных для спорообразования. Однако имеются данные, указывающие на наличие стабильных споруляционных иРНК. Добавление меченого актиномицина D к культуре Bac. subtilus через определенные промежутки времени от начала процесса спорообразования позволило обнаружить различные классы спороспецифичных иРНК /32/.

Результаты изучения ДНК-РНК-гибридизации также указали на существование стабильной фракции иРНК в прикрепленных к мембране полирибосомах спорулирующих клеток, обработанных актиномицином D. Рядом исследователей показано, что при переходе к споруляции рибосомы вегетативных клеток претерпевают изменения. В результате использования белок-синтезирующей системы in vitro обнаружено, что у Bac. subtilus рибосомы становятся неспособными транслировать вегетативные иРНК при переходе клеток к споруляции. Таким образом, на основании данных, указывающих на наличие стабильной фракции иРНК, изменений в структуре рибосом, конформационных изменений в клеточной мембране, можно предполагать возможность функциональных изменений механизма, который определяет специфичную для процесса спорообразования трансляцию /31/.

Посттрансляционная регуляция спорообразования. Регуляция спорообразования на посттрансляционном уровне в настоящее время изучена недостаточно, однако считается, что этот вид регуляции, связанный с модификацией белков клетки, является необходимым для завершения споруляционного процесса. Обнаружен специфичный состав белков для каждой стадии спорообразования. Считается, модификация РНК-полимеразы, субъединиц рибосом и мембранных компонентов клетки происходит в результате посттрансляционных изменений и связана с фосфорилированием, аденилированием уже существующих белков, а также с образованием пептидных антибиотиков /27/.

Роль щелочной протеиназы в процессе спорообразования. В процессе споруляции Bac. subtilus образуются тир протеолитических активных фермента: сериновая протеиназа (субтилизин), работающая при щелочных значениях рН, в связи с чем в литературе обычно приводится название щелочная протеиназа; металлсодержащая протеиназа (нейтральная), рН оптимум которой находится в нейтральной зоне рН, и эстераза – фермент, обладающий невысокой протеолитической активностью. Различные представители рода Bacillus обладают специфической способностью к образованию определенного типа внеклеточной протеиназы. Так, Bac. megaterium и Bac. cereus синтезируют только нейтральную протеиназу, в то время как Bac. licheniformis, Bac. natto и Bac. subtilis образуют как нейтральную, так и щелочную протеиназы. Следует отметить, что Bac. subtilis по способности образования протеиназы различного типа можно подразделить на четыре группы; к первой относятся штаммы, синтезирующие только щелочную протеиназу, вторая группа образует только нейтральную протеиназу, представители третьей группы выделяют в среду как щелочную, так и нейтральную протеиназы, щелочная протеиназа у представителей четвертой группы появляется в среде только после того, как исчезнет нейтральная протеиназа /34/.

Установлено, что нейтральная протеиназа не участвует в процессе спорообразования, тогда как щелочная протеиназа необходима для включения данного процесса. В частности, выделен температурочувствительный по щелочной протеиназе мутант Bac. subtilis ts5. В условиях инкубации при 470С, т.е. температуре, при которой проявляется дефект температурочувствительного субтилизина, мутант не спорулировал. Восстановление активности щелочной протеиназы при 300 сопровождалось споруляцией вегетативно растущих клеток. Момент нарушения процесса спорообразования у данного ts5 мутанта совпадает с 0 стадией споруляции /35/.

В то же время описана большая группа плейотропно негативных мутантов, которые имели блок на 0 стадии спорообразования и характеризовались отсутствием способности к образованию щелочной протеиназы. Таким образом, из представленных данных можно судить о наличии корреляции между образованием щелочной протеиназы и спорообразованием. В последующих работах для определения участия протеиназ в процессе споруляции использовали два подхода. Первый подход состоял в создании условий, при которых ингибируется спорообразование. Обнаружено, что клетки, голодающие по тимидину, не спорулируют и не образуют такие экзоферменты, как протеиназы, рибонуклеазы, щелочную фосфатазу, при это не затрагивается только образование a-амилазы. На основании этих данных авторы предложили, что указанные ферменты прямо или косвенно связаны со спорообразованием /36/.

Вторым подходом для определения участия именно щелочной протеиназы в споруляционном процессе послужило использование специфичного ингибитора щелочной протеиназы – фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Добавляя ингибитор через различные промежутки времени от начала процесса образования спор, обнаружили, что в осуществлении данного процесса имеется чувствительный период, продолжающийся 2–3 часа. Добавление ингибитора в этот период приводит к нарушению спорообразования, при этом не образуется щелочная фосфатаза, рибонуклеаза и термоустойчивые споры. Уровень синтеза нейтральной протеиназы в отсутствие ингибитора постоянно возрастает к началу спорообразования, затем либо незначительно снижается, либо достигает плато. Добавление PMSF приводит к возрастанию уровня накопления нейтральной протеиназы, при этом спорообразование отсутствует. На основании этих данных авторы сделали вывод о том, что нейтральные протеиназы по мере своего накопления разрушаются щелочной протеиназой и не участвуют в спорообразовании /26/.

Подтверждением того, что нейтральная протеиназа не принимает участия в процессе споруляции, послужили нормально спорулирующие мутанты Bac. subtilis, не обоазующие металлсодержащей протеиназы. Мутанты же, дефектные по образованию щелочной протеиназы, как правило – аспорогенны. Добавление ингибитора щелочной протеиназы после чувствительного периода не нарушает ни образования щелочной фосфатазы, ни появления светопреломляющих спор. Следовательно, щелочная протеиназа необходима для осуществления первых этапов спорообразования, в частности 0–1. Несмотря на то, что фермент продолжает накапливаться в течение всего периода спорообразования, для дальнейшего развития споры, по мнению авторов, щелочная протеиназа не явялется необходимой /27/.

Вместе с тем в ряде работ была показана важная роль щелочной протеиназы в модификации ферментов на поздних этапах спорообразования. Например, показано, что протеиназа может превращать фермент вегетативных клеток фруктозо-6-фосфатальдолазу в белок, специфичны для зрелых спор Bac. subtilis. Не исключено также возможное участие щелочной протеиназы в прорастании спор, при этом предполагают, что щелочные протеиназы, гидролизуюя белковую оболочку спор, включают их прорастание.

Все приведенные выше работы касаются роли внеклеточной щелочной протеиназы в спорообразовании.

Вместе с тем установлено, что к моменту начала процесса спорообразования Bac. subtilis образуется также и внутриклеточная щелочная протеиназа, уровень активности которой составляет 10% от соответствующего уровня внеклеточного фермента. Другие виды Bacillus, например Bac.megaterium, синтезируют, в отличие от Bac. Subtilis, толькл внутриклеточную щелочную протеиназу. В некоторых химических свойствах двух протеиназ существуют различия. В частности, указывается на наличие различной потребности в кофакторах и субстратной специфичности. Было также обнаружено, что двум щелочным протеиназам свойственна различная электрофоретическая подвижность. Внутриклеточная протеиназа обладает более узкой специфичностью в отношении эфиров и абсолютной потребностью в кальции. До последнего времени неясным остается вопрос о роли внутриклеточной протеиназы в спорообразовании Bac. Subtilis, хотя и описаны мутанты, у которых наряду с отсутствием активности внутриклеточной протеиназы не осуществляется процесс споруляции /34/.

 Скачать реферат