Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения

За счёт использования данного штамма В. methylicum удалось выделить порядка 1 г L-Phe из 1 л среды.

Исследование биосинтеза L-фенилаланина штаммом В. methylicum. Общей особенностью биосинтеза L-Phe в протонированных средах было значительное увеличение его продукции на ранней фазе экспоненциального роста В. inethylicum, когда выход микробной биомассы был не

значителен (рис. I).

Рис. I. Динамики роста В. methylicum (la, 10'а, 10а) и накопления L-Phe в культуральной жидкости (16, 10'б, 106) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б - исходный микроорганизм на протоннрованной среде М9; 10' а,б -адаптированный В. methylicum на полностью дейтерированной среде; 10 а,б - еадаптированный микроорганизм на полностью дейтерированной среде.

Во всех изотопных экспериментах наблюдалось ингибирование биосинтезаL-фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов, наблюдаемый характер динамики секреции L-Phe не коррелировал с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции. Скорее всего, накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза, что отмечено в работах других авторов (Ворошилова Э. Б., Гусятипер М. М., 1989). Данные по исследованию культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) показали, что кроме L-фенилаланина данный штамм В. methylicum синтезирует и накапливает в культуральной жидкости другие аминокислоты (аланин, валин, лейцин, изолейцин), четко детектируемые масс-спектрометрическим анализом (см. след, главу).

Изучение качественного и количественного состава внутриклеточных сахаров В. subtilis. Входе выполнения работы был изучен качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров при росте В. subtilis на среде с 99,9 ат.% тяжёлой воды (см. табл. 3). Как видно из таблицы 3, в гидролизатах биомассы данного штамма фиксируются глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза, сахароза и мальтоза.

Таблица 3.

Качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров В. subtilis при росте на 99,9 %тяжёлой воде.

Изучение аминокислотного состава биомассы метилотрофных бактерий В. tnethylicum. Аминокислотный состав суммарных белков биомассы В. methylicum, полученного в ходе многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде показан в таблице 4. Результаты исследования показали небольшое снижение содержания в дейтерированном белке Ala, Leu и Нis по сравнению с белком, полученным на обычной воде (табл. 4).

Таблица 4.

Качественный и количественный состав аминокислот общих белков биомассы В. methylicum.

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. subtilis на средах, содержащих тяжёлую воду и гидролизаты метилотрофных бактерий. Кривые, отражающие динамику роста, ассимиляции глюкозы и накопление инозина в культуральной жидкости штаммом В. subtilis в условиях протонированной среды и среды, с 99,9 ат.% тяжёлой воды представлены на рис. 2.

Как видно из рис. 2, при переносе клеток со стандартной на дейтерированную среду выход микробной биомассы, продолжительность лаг-фазы и длительность времени клеточной генерации в целом изменяются незначительно. При росте исходного штамма В. subtilis па среде, содержащей обычную воду уровень накопления инозина в культуральной жидкости достигал величины 17,3 г/л после пяти суток культивирования (рис. 2). Уровень накопления инозина на дейтерированной среде был снижен в 4,4 раза по-сравнению с исходным штаммом на протонированной среде (рис. 2). Низкие уровни секреции инозина на дейтерированной среде коррелируют со степенью конверсии глюкозы в этих условиях. Так, кривая конверсии глюкозы на полностью дейтерированной среде имела меньший угол наклона, чем на среде с обычной водой, что свидетельствует о том, что при росте на дейтерированной глюкоза расходуется менее эффективно (рис. 2).

 Скачать реферат