Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения

Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжёлой воды в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к тяжёлой воде будет оказывать благоприятный эффект на скорость роста культуры. При этом штамм М. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях D2

О в среде 74,5 об.%. Роста бактерий на более высокой концентрации тяжёлой воды достичь не удалось. В связи с этим, в экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали препараты культуральной жидкости и биомассы М. flagellatum, полученные со среды, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Концентрация экзогенного дейтерометанола CD3ODсоставляла, как обычно, 1 об.%.

Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum. Попытки адаптировать штамм В. methylicum к росту при сохранении способности к биосинтезу L-фенилаланина на максимально дейтерированной среде привели к желаемому результату. К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специально разработанный нами подход поадаптации, который заключался в серии из пяти адаптационных пассажей исходной культуры на агаризованных средах (с добавкой 2 об. % дейтерометанолом CD3OD) при ступенчатом увеличении концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 об% до 98 об% D2O) и последующей селекции устойчивых к тяжёлой воде клонов бактерий. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих тяжёлую воду. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированпости, включая среду с 98 об.% тяжёлой водой (степень выживаемости бактерий на конечной полностью дейтерированной среде составляет не более 40%).

Полученный результат в опытах по адаптации В. methylicumк тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты его биомассы, а также саму биомассу, полученную в ходе многоступенчатой адаптации к D2O в качестве полноценных ростовых субстратов для выращивания бациллярных штаммов В. subtillis и В. amytoliquefaciens, а также штамма галофильных бактерий Н. halobium ET1001.

Адаптация бацилл В. subtittis и В. amyloliqucfaciens. В следующих опытах была исследована способность к росту на тяжёлой воде бациллярных штаммов В. subtillis (his, tyr, ade, иrа), и В. amyloliquefaciens (ade, иrа), продуцентов инозина и тимидина, соответственно. Мы предположили, что замедление роста бактерий на минимальных средах, содержащих тяжёлую воду могло быть обусловлено появлением ауксотрофности по отдельным ростовым факторам. Чтобы проверить это предположение, в дальнейшем мы использовали комплексные среды. Как и предполагалось, обе культуры удалось адаптировать к дейтерию путём рассева на твёрдые среды, приготовленные из99,9 ат.% тяжёлой воды. Они сразу обнаружили нормальный рост на тяжёлой воде. У штаммов В. subtilis и В. amyloliquefaciens при росте на тяжёлой воде было отмечено сохранение высокого уровня продукции по инозину и тимидину (3,9 и 3,0 г/л соответственно).

Адаптация галофильных бактерий Н. halobiumET1001. В случае с Н. halobium ET 1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% тяжёлую воду путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой среде с тяжёлой водой. В обычных для этой бактерии условиях культивирования (37°С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина.

2. ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И БИОСИНТЕЗА БАС ПОЛУЧЕННЫМИ ШТАММАМИ

Изучение ростовых характеристик М. jlagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O, а также 13СНзОН. Данные по росту штамма М. Jlagellatum на минимальных средах с добавкой 1 об.% метанола СНзОН и его меченных аналогов (СDзOD/13СНзОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице I. Как видно из таблицы I, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола – дейтеро-метанол CD3OD и 13С-метанол 13CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% тяжёлой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНзОН (табл. 1, опыты 1,3,8). Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости роста бактерий.

Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост штамма M.flagelaum.

 Скачать реферат