Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения
2. Методы получения дейтерий- и 13С -аминокислот, [1',3',4'D,8-инозина и бактериородопсина за счёт биологической конверсии дейтерометанола/13С метанола СDзОD/13СНзОН и тяжёлой воды D2O.
3. Метод прямой химической модификации препаратов интактных культуральных жидкостей дансиллхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном. Применение данного метода для масс-спектрометрического анализа степен
ей изотопного обогащения молекул аминокислот в составе мультикомпонентных смесей при данном способе введения метки.
Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 3-м международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и их аналогам (Вена, август, 1993), на 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии"(Екатеринбург, апрель, 1994), 6-й международной конференции по ретинальным белкам (Ляйден, июнь, 1994), 7-м международном симпозиуме по генетике промышленных штаммов микроорганизмов (Монреаль, июль, 1994), 8-м международном симпозиуме по микробному росту на Ci-соединениях (Сан-Диего, август, 1995), Евроазийском симпозиуме по современным направлениям в биотехнологии (Анкара, ноябрь, 1995).
Публикации. Поматериалам диссертационной работы опубликовано восемь печатных работ и шесть тезисов научных конференций.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, выводов. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 15 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы и питательные среды.
Исследования проводили с генетически маркированными штаммами-продуцентами аминокислот, белков и нуклеозидов:
Штамм №l. - BrevibacteriummethylicumВКПМ В 5652 (leu), штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.
Штамм №2. - Methylobacillusflagellatum КТ (ile), штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.
Штамм №3. - Bacillussubtilis (his, tyr, ade, иrа), штамм граммотрицательиых бактерий, продуцент инозина.
Штамм №4. - Bacillusamyloliquefacien ade, иrа), штамм грамм отрицательных бактерий, продуцент тимидина.
Штамм №5. - HalobacteriumhalobiumET 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.
В настоящей работе использовали следующие питательные среды.
1. Минимальная среда М9 (Miller J., 1976). Среду использовали для ферментации штаммов №1 и №2 и выделения отдельных колоний.
2. Комплексная ферментационная среда (ФМ-среда) (Казаринова Л.А, 1980). Среду использовали для ферментации штаммов №3 и №4.
3. Синтетическая среда TS(Gibson Т., 1962). Среду использовали для ферментации штамма №5.
Условия адаптации и культивирования бактерий на дейтерий-содержащих средах.
Адаптацию клеток к дейтерию проводили на твёрдых агаризованных средах (2 %-ный агар), с тяжелой водой. При этом использовали как простой рассев культур до отдельных колоний на средах, приготовленных из 99,9 ат.% тяжёлой воды, так и многостадийную адаптацию бактерий на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды.
Для биосинтеза меченных БАС использовали среды тех же составов, приготовленные на основе тяжёлой воды и дейтерометанола D2О/СDзОD с использованием безводных реагентов. Полученную таким образом биомассу В. mehylicum гидролизовали в DCI и использовали в качестве источника суммарных химических компонентов для культивирования штаммов №3 и №5 соответственно.
13С-аминокислоты были получены за счёт конверсии 13СНзОН в метилотрофных бактериях.
Для введения дейтерия в молекулу бактериородопсина использовали селективную синтетическую среду TS, в которой ароматические аминокислоты -L-Phe, L-Tyr и L-Тгр были замещены их дейтерированными аналогами - L-[2,3,4,5,6-Ds]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D3]-Trp.
Методы выделения и анализа изотопно-меченых БАС.
Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайера и Дайера (Bligh E.G Dyer W.J, 1959).
Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом (Beyrich Т., 1965).
Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 по методу Остерхельда и Стохениуса (Oesterhdt О., & Stohenius, 1976).
Гидролиз белка проводили с использованием 4 н. Ва(ОН): и 6 н. DC1 ( в D2О)(110°С,24ч).
Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали в ходе реакции Шоттена-Баумана (GreensteinJ., Winitz M., 1961).
Дансильные производные аминокислот получали по методу Греема и Хартли (GreemB., Hartly В, 1963).
Метиловые эфиры дансил-аминокислот получали по методу Физера (Fiser J., 1963).
Аналитическое и препаративное разделение бензилоксикарбонильных производных аминокислот проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т.А., 1993).
Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили на жидкостном хроматографе "Кпаиег" (ФРГ), снабженным УФ-детектором "2563" и интегратором "C-R ЗА" (Shirnadzu, Япония). Неподвижная фаза: Separon SGX С 18,1 мкм, 150 х 3,3 мм (Kova, Чехословакия). Использовали градиентное элюирование растворителями: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил (от 20% В до 100% В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин),
Ионнообменную хроматографию проводили па приборе "Biotronic LC 500!" (ФРГ), 230x3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч, детекция при 570 нм и 440 нм.
Масс-спектры электронного удара получены на приборе "МВ-80А " (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Масс-спектры FAB были получены на приборе " MBA " (Hitachi, Япония) при ионном токе 0,6-0,8 мА.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ БАС, АДАПТИРОВАННЫХ К
РОСТУ И БИОСИНТЕЗУ НА СРЕДАХ С МАКСИМАЛЬНЫМИ
КОНЦЕНТРАЦИЯМИ ТЯЖЁЛОЙ ВОДЫ.
Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum. В связи с важностью препаративного аспекта получения дейтерий-меченных соединений в рамках данной работы была изучена возможность адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту на средах с максимальными концентрациями тяжелой воды (D2O). Для этого были проверены представители различных таксономических групп метилотрофных бактерий, имеющихся в коллекции ГосНИИ Генетики: L-лейцин-продуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum (ileu), реализующий 2-кего-3-дезокси-6-фосфогдюконат-альдолазный (КДФГ) вариант рибулё'зо-5- монофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода и L-фенилаланин-продуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum (leu), ассимилирующий метанол по РМФ- циклу.
Скачать реферат