Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения
Как и следует из литературных данных (Складнее Д. А, 1990), введение стабильного изотопа углерода |3С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с М. flage/talum. В целом, полученные для М. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаб
олизма. Кроме этого, из таблицы 1 следует, что данный подход можно эффективно использовать для введения в синтезируемые БАС двойной изотопной метки (дейтерий- и изотоп углерода 15C).
Изучение ростовых и биосинтетических характеристик Б. methylicum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O. Данные по росту исходного и адаптированного к тяжёлой воде штамма В. methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3OН/CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2. Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. табл. 2, опыт 1). С увеличением концентрации тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% CD3OD (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).
Таблица 2.
Влияние изотопного состава среды на рост штамма В. mehylicumи уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости*.
|
Номер Компоненты среды, об% лаг-фаза Выход Время Выход опыта биомассы генер. L-Phe, Н2 О D2O СH3ОН CD3OD ч % ч % | ||||||||
|
1 |
98 |
0 |
2 |
0 |
24,0 |
100 |
2,2 |
100 |
|
2 |
98 |
0 |
0 |
2 |
30,3 |
92,3 |
2,4 |
99,1 |
|
3 |
73,5 |
24,5 |
2 |
0 |
32,1 |
90,6 |
2,4 |
96,3 |
|
4 |
73,5 |
24,5 |
0 |
2 |
34,7 |
85,9 |
2,6 |
97,1 |
|
5 |
49,0 |
49,0 |
2 |
0 |
40,5 |
70,1 |
3,0 |
98,0 |
|
6 |
49,0 |
49,0 |
0 |
2 |
44,2 |
60,5 |
3,2 |
98,8 |
|
7 |
24,5 |
73,5 |
2 |
0 |
45,8 |
56,4 |
3,5 |
90,4 |
|
8 |
24,5 |
73,5 |
0 |
2 |
49,0 |
47,2 |
3,8 |
87,6 |
|
9 |
0 |
98,0 |
2 |
0 |
60,5 |
32,9 |
4,4 |
79,5 |
|
10 |
0 |
98,0 |
0 |
2 |
64,4 |
30,1 |
4,9 |
71,5 |
|
10' |
0 |
98,0 |
0 |
2 |
39,9 |
87,2 |
2,9 |
95,0 |
'Данные (1-10) приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.
Данные 10' приведены для адаптированного В. methylicum.
Как видно из табл. 2, опыт 2, дейтерометанол CD3OD не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выход микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% тяжёлой водой микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и 2 об.% дейтерометанола СDзОD, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза no-сравнению с контролем. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к тяжёлой воде штамма В. inethylicum в полностью дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 12,8% и 5% соответственно (табл. 2, опыт 10').
Скачать реферат