Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения

Дейтерий- и 13С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов суммарного белка биомассы были разделены методом ОФ ВЭЖХ со степенью хроматографической чистоты 93-96% и выходами 75-89% в условиях, аналогичных таковым для разделения секретируемых аминокислот (табл. 6). Хотя в таблице 6 приведены данные только для 10 аминокислот, очевидно, что в остальных аминокислотах уровни изотопного включения со

поставимы, хотя они не детектируются данным методом. Это предположение подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методом ионнообменной хроматографии на колонке "Biotronic LC 5001", где детектируется уже 15 аминокислот (см. рис. 4).

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. methylicum па средах с тяжёлой водой.

Общие принципы изучения степени изотопного обогащения молекул аминокислот при данном способе введения метки продемонстрированы на примере анализа включения дейтерия в мультикомпонентные смеси аминокислот, полученные после гидролиза суммарных белков биомассы в 6 н. DCl и 4 н. Ва(ОН).

Во всех -экспериментах по научению содержания дейтерия в аминокислотных остатках белка наблюдалась корреляция между степенью изотопного насыщения среды и уровнями включения дейтерия в аминокислоты (табл. 6), Например, для индивидуальных аминокислот белковых гидролизатов количество включенных атомов дейтерия по скелету молекулы варьирует незначительно в пределах 49%-ной концентрации тяжёлой воды и составляет для Ala 45%, Val - 36,3%, Leu/Ile - 42%, Phe -37,5%.

Таблица 6.

Степени включения D и 13С в аминокислотные остатки общих белков биомассы В. melhyiicum* и М. flagellatum**.

'Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. melhyiicum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O. **Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О.

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. melhyiicum на максимально дейтерированной среде. Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения дейтерия в аминокислотные остатки белков за счет адаптации культуры В. melhyiicum к росту и биосинтезу на среде с максимальной концентрацией тяжёлой воды. Как видно из таблицы 6, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды, степени включения дейтерия в остатки Gly, Ala и Phe составляют 90, 97,5 и 95%, т.е. уровень мечения можно считать униформным. Низкие степени включения дейтерия в молекулы лейцина (49%), а также в метаболически связанных аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированной форме. Полученный результат по разбавлению дейтериевой метки в лейцине может быть объяснён сохранением доли минорных реакций в биосинтезе лейцина de novo.

Исследование степеней включения изотопа углерода I3C в аминокислотные остатки белка М.

flagellation за счёт биоконверсии 13СH3ОН.

В экспериментах по включению изотопа углерода |3С в молекулы белков за счёт биоконверсии 13СH3ОН метилотрофными бактериями М.flagellalum была показана эффективность мечения аминокислот изотопом углерода 13С. Так, в Phe детектировалось 80,5 % метки, в Ala - 95 %, в Gly - 90% (см. табл. 6).

Во всех экспериментах степени включения дейтерия и изотопа углерода 13С в метаболически связанных аминокислотах обнаружили определённую коррелляцию. Так, степени изотопного обогащения валина и лейцина (семейство пирувата), фснилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот} совпадают (табл. 6). Степени изотопного включения глицина и серина (семейство серина), аспарагиповой кислоте и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Сравнивая данные таблицы 5 и 6, можно заключить, что степени изотопного обогащения экзогенных аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка, в целом, также коррелируют.

 Скачать реферат