Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения

Рис.2. Динамики роста B.subtilis (1a, 2a), конверсии глюкозы (1б,2б) и накопления инозина в культуральной жидкости (1в,2в) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б,в-B. Subtilis на обычной протонированной среде; 2 а,б,в-B.subtilis на полностью дейтерированной среде с гидролизатом дейте

ро-биомассы метилотрофных бактерий.

Полученные для исследуемых микроорганизмов данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация клетки к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжёлой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время обратимость роста на D2O/H2O-cpeдax теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в тяжёлой воде, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. Можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы ферментных систем в тяжёлой воде. Также не исключено, что наблюдаемые при адаптации эффекты связаны с образованием в тяжёлой воде более прочных и стабильных связей, чем связей с участием водорода. По теории абсолютных скоростей разрыв С-Н-связей может происходить быстрее, чем C-D-связей, подвижность дейтерия D+меньше, чем подвижность протия Н+, константа ионизации D2O в 5 раз меньше константы ионизации Н2О (Crespy J., Kalz H.H., 1979). С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене протия на дейтерий могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей.

3. ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНЕЙ ВКЛЮЧЕНИЯ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ и УГЛЕРОДА 13С в МОЛЕКУЛЫ ЭКЗОГЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ B. methylicumи М. flagellatum.

Получение препаратов культуральных жидкостей, содержащих экзогенные дейтерий - и 13С-аминокислоты. Дейтерий-меченные аминокислоты были выделены в составе препаратов лиофилизованных интактных культуральных жидкостей, свободных от белков и полисахаридов, при росте штамма В. methylicum на минимальных средах с добавкой 2 об% метанола СНзОН и с различным содержанием тяжёлой воды. |3С-аминокислоты были получены за счет культивирования штамма М, flagellatum на среде, содержащей обычную воду и 1 об% 13С-метанол |3СНзОН. Данные по степеням включения дейтерия и 13С в молекулы экзогенных аминокислот двух исследуемых штаммов приведены в таблице 5. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости независимо от рода штаммов методом масс-спектрометрии электронного удара были обнаружены аланин, валин, лейцин/изолейцин и фенилаланин (табл. 5). В масс-спектрах дериватизованной культуральпой жидкости M.flagellatwn в дополнение к вышеобозначенным аминокислотам также фиксировался глицин.

Получение метиловых эфиров дансил-и карбобензокси-проазводных аминокислот. Степени включения изотопов дейтерия и мзотопа углерода 13С в мультикомпонептные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом высокочувствительной масс-спектромстрии электронного удара метиловых эфиров Dns-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ОФ ВЭЖХ.

Аналитическое и препаративное разделение Z-производных аминокислот проводили методом ОФ ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т. А., 1993). Степени хроматографической чистоты выделенных из культуральных жидкостей В. methylicwn и М. flagellatum 2-й Dns-производных дейтерий- и 13С-аминокислот составили 93-95%, а выходы 65-87% соответственно.

Предложенная нами модификация метода получения производных аминокислот заключалась в прямой химической обработке препаратов культуральной жидкости, полученной после отделения клеток, DnsCI (и ZCI) и CN2H2. Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении DnsCl (ZCI) -аминокислота, равным 5:1 (см. схему ниже).

Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с моно-производными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns5)-тирозина, О,N-ди-Z,(Dns)-серииа, O,N-AH-Z,(Dns)-Tpeoнина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин.

Летучесть Dns-и Z-производных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана в качестве этерифицирующего реагента был связан с необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих обратный изотопный (H-D-обмен в ароматических аминокислотах. При использовании диазометана происходило дополнительное N-метилирование по a-NH2-rpynne аминокислот, в результате чего в масс-спектрах метиловых производных аминокислот фиксировались дополнительные пики, соответствующие соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных.

Исследование степеней включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина В. methylicum, полученного со сред с тяжёлой водой. Как видно из данных таблицы 2, рост данного штамма метилотрофных бактерий на средах с возрастающими концентрациями тяжёлой воды сопровождался снижением уровней накопления клеточной биомассы, увеличением времени генерации бактерий и продолжительности лаг-фазы при сохранении способности синтезировать и накапливать L-фенилаланин в ростовой среде. Поэтому было интересно изучить, как изменяются степени включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина и других аминокислот В. methylicum в этих условиях.

Во всех опытах наблюдалось специфичное возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при ступенчатом увеличении концентраций тяжёлой воды в ростовой среде (табл. 5). Так, для индивидуальных аминокислот культуральной жидкости В. melhylicum, количество включённых атомов дейтерия по скелету молекул варьирует в пределах 49%-ной концентрации D2O и составляет для Phe 27,5%, Ala - 37,5%, Val - 46,3%, Leu/Ile - 47% (табл. 5). Аналогичное увеличение молекулярной массы аминокислот в зависимости от концентрации тяжёлой воды в среде было зафиксировано во всех экспериментах.

Таблица 5.

Степени включения дейтерия- и изотопа углерода 13С в молекулы секретируемых аминокислот В. melhylicum* и M. flagellation**.

 Скачать реферат